Ses exploits sur le terrain sont tels qu’il est transféré en 2004 pour 24 millions d’euros au FC Barcelone, l'ennemi du Real Madrid où – malgré la richesse de l’effectif – il est devenu un titulaire indiscutable. Là, il éclate au plus haut niveau : 24 buts en Liga, 4 en Ligue des Champions, un titre de champion. Sans compter que le Camerounais marque régulièrement contre son ancien club madrilène.

Malgré la déception liée à l'élimination du Cameroun pour la Coupe du monde 2006, la saison 2005 commence sur les chapeaux de roues : le Barça tutoie les sommets et Eto'o empile les buts : meilleur buteur ou Pichichi de la Liga avec 26 buts, 6 en Ligue des Champions dont un en finale qui donne le trophée à son club. Alors que sa carrière semblait lancée sur les chapeaux de roue, Samuel Eto'o se blesse tout seul lors de la rencontre de Ligue des Champions opposant le FC Barcelone au club allemand du Werder de Brême. Le verdict est sans appel : cinq mois d'indisponibilité pour le buteur blaugrana.

A l'été 2007, Thierry Henry signe au Barça et la concurrence promet d'être rude. Mais Eto'o se blesse avant le deuxième match de la saison et son indisponibilité ne permet pas de voir le choix tactique de Frank Rijkaard. Dans le même temps, il est annoncé partant vers le Milan AC, champion d'Europe 2007, pour plus de 60 millions, mais il refuse l'offre souhaitant rester en Espagne précisément en Catalogne.